La Chiesa Matrice di Alberobello è consacrata all'Immacolata Concezione e ai Santi Cosma e Damiano, patroni del comune con decreto pontificio del lunedì 22 maggio 1854.
Il loro culto fu introdotto nel 1636 dal conte Giangirolamo II, che ne era devoto a motivo di una grazia ricevuta da sua moglie Isabella da Rocca Padula durante la gravidanza con la quale diede alla luce il primogenito, Cosimo Duca di Noci, infatti fu l'unico d'Acquaviva a possedere questo nome. Prima dell'istituzione della parrocchia, la cappella, risalente al 1609 dipese dalla parrocchia di Noci sino al 16 marzo 1814. Il vescovo di Conversano monsignor Gregorio Falconieri la riconobbe come santuario il 12 Settembre 1938 e il 18 Febbraio 2000 papa Giovanni Paolo II la elevò a basilica minore.
L'edificio attuale, in stile neoclassico con pianta a forma di croce latina, risale alla fine del XIX secolo. Sostituisce una piccola cappella risalente al 1609 e si presuma consacrata alla Madonna delle Grazie con sotto l'ossario, denominato Salvo, raddoppiata nel 1725, allungata nel 1784 con sacrestia e nel 1852 in formazione dei due transetti, il vecchio campanile realizzato nel 1875. Il progetto, voluto fortemente nel 1881 dall'amministrazione comunale Nicola Agrusti, fu redatto dell'architetto alberobellese Antonio Curri, ebbe il benestare del parroco Domenico Morea. Il preventivo era di 16.000 lire, la realizzazione costò 32.700 lire. La prima pietra fu posata la domenica 12 novembre 1882 e i lavori durarono quasi tre anni. La nuova chiesa fu aperta al culto il 20 Settembre 1885 in occasione della festa dell'Addolorata, in cui fu posta la epigrafe sull'ingresso, anche se la sua realizzazione era largamente incompleta essendo state realizzate solo navata centrale esternamente e la facciata, a facciata presenta due campanili, quello di sinistra con una meridiana e quello di destra con un orologio con numeri romani. L'interno della navata completata a fine '800, l'abside e la nuova, completata a inizio '900, la sacrestia, già presente dal 1784, anche la sacrestia vecchia fu demolita e ricostruita quella nuova e restaurata e completata nel 1968, nel 1935 fu aperto il cappellone del Santissimo Sacramento, il braccio sinistro fu completato nel 1948 e il braccio destro nel 1956, mentre la prevista cupola ottagonale, di cui nel 1960 fu realizzata la base, non è mai stata realizzata.
La chiesa custodisce le reliquie dei Santi Titolari, festeggiati il 27 e 28 settembre.
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