Si trova al centro e nel punto più alto dell'isola, sito probabilmente destinato ad area sacra sin dall'antichità. Per l'opera furono chiamati i costruttori locali Francesco Bischettimi e Scipione Lachibari, i quali seguirono il disegno dell'intera fabbrica realizzato da Giovan Bernandino Genuino. A causa dell'elevato numero di tele può essere considerata una vera e propria Pinacoteca. È una chiesa barocca del XVII secolo, riedificata in sostituzione dell'antica chiesa romanica intitolata a san Giovanni Crisostomo. Il canonico della cattedrale D'Elia sostenne che la Basilica risaliva al XII e quindi doveva avere uno stile normanno romanico-pugliese. Nel 1629 si distrusse l'antico tempio e si pose la prima pietra della nuova Chiesa, alla presenza dell'arciprete Michele di Valandia, alto prelato del Capitolo, supplente del vescovo Rueda assente. Fondamentale fu la donazione fatta a tal proposito dal medico, filosofo, docente, letterato di Gallipoli Giovanni Giacomo Lazzari. Un'iscrizione posta dall'allora vescovo di Gallipoli Oronzo Filomarini (posta oggi sopra l'entrata della sacrestia) spiega l'origine della Cattedrale, un tempo dedicata a San Giovanni Crisostomo.

 

Il prospetto, in carparo, è diviso in due ordini. Il primo si presenta scandito da lesene-paraste scanalate di ordine dorico intervallate dai portali di accesso alle navate e dalle nicchie contenenti le statue di sant'Agata, di san Fausto e di san Sebastiano. Sotto alla statua di san Sebastiano è presenta la scritta latina: «ISTEQUE MORBO L1BERAT URBEM». Il secondo, per cui furono adottate soluzioni fornite dall'architetto leccese Giuseppe Zimbalo, ospita, in corrispondenza delle due nicchie presenti nel piano inferiore, altrettante nicchie, inquadrate da decorate cornici leggermente timpanate, in cui trovano sistemazione le statue di santa Marina, a sinistra, e di santa Teresa d'Avila, a destra. Fra le due paraste ioniche si apre un grande finestrone a nido d'ape mentre sui riccioli delle volute di raccordo sono impostati i busti dei santi Agostino e Giovanni Crisostomo. Il prospetto culmina con un frontone su cui è posta la data 1696, anno in cui venne completato.

 

La Chiesa Cattedrale non è dotata di una torre campanara: le tre campane(in passato quattro) sono infatti poste sulla terrazza e montate sul fronespizio con delle aperture (si parla per questo di campanile a vela). La torre che è adiacente alla Basilica Cattedrale è invece la torre civica, composta da due campane che scandiscono però la vita civile. In passato vi erano due campanili asimmetrici: quello di sinistra era composto da tre piani e da aperture bifore; terminava con un campanone e con due battitori delle ore; quello di destra aveva dimensioni maggiori e composto da ben cinque piani e terminava con un'estremità a cupola con una croce.

 

Adiacente alla basilica cattedrale di Gallipoli, è presente il Museo diocesano di Gallipoli. Nacque nel 2004 con il contributo della Conferenza Episcopale Italiana, dell'Unione europea, della Regione Puglia e della diocesi stessa. L'edificio in cui è situato è l'antico palazzo del seminario costruzione barocca del 1750. Il palazzo del seminario, su indicazione del concilio di Trento, fu voluto dal vescovo De Ruenda. Il progetto elaborato fu ripreso dal vescovo Serafino Brancone. Alla costruzione contribuì il comune della stessa città con una donazione di 300 ducati e dopo aver venduto alcuni beni appartenenti all'abbazia di San Mauro di Sannicola. Il 16 marzo 1752 fu posta la prima pietra di costruzione, ad opera di mastro Adriano Preite da Copertino. Il palazzo fu terminato nel 1756 ed inaugurato nel 1760 dal vescovo Ignazio Savastano. L'esterno è riccamente decorato con una squisita grazia barocca con temi e motivi ripresi poi da altri palazzi di Gallipoli, come palazzo Doxi. Dal 12 luglio 2004 è sede del museo diocesano: contiene numerosi dipinti, quadri, tesori e paramenti ecclesiastici del 1600-1700 oltre ai busti argentei di sant'Agata e san Sebastiano, patroni gallipolini. All'interno del museo sono presenti numerosissime collezioni di paramenti sacri, campane, arredamenti, tele, le statue argentee-dorate dei santi protettori oltre all'imponente baldacchino, appartenuto a mons. Oronzo Filomarini, vescovo dal 1700 al 1741.